Simone多肽化学合成的基本步骤讲解
的有关信息介绍如下：
多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。
1.1．氨基酸保护基
20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。
表1 常见3种氨基脱除条件
TFA HBr/TF H2/Pd Piperidin
A -C e/DMF
Boc y y n n
Z n y y n
Fmoc n y n y
图1 常见3种氨基保护基结构
氨基酸侧链保护基团非常多，同一个侧链有多种不同的保护基，可以在不同的条件下选择性的脱除，这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义。而且侧链保护基和选择的合成方法有密切的关系，液相和固相不一样，固相中BOC和FMOC策略也不一样，从某种意义上看，多肽化学就是氨基酸保护基的灵活运用与搭配。关于侧链保护基的使用，请参考王德心的《固相有机合成——原理及应用指南》第四章，我们这里主要介绍Cys，Lys，Asp的几种保护基及其脱除方法。Cys最常见的保护基有三种，Trt，Acm，Mob，这三个保护基可以完成多对二硫键多肽的合成。Lys最常见的保护基有：Boc，Fmoc，Trt，Dde，Allyl，这对于固相合成环肽提供了很多正交的保护策略。Asp最常见的保护基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同样也提供了多种正交的保护策略。
表2 巯基常见保护基
简称 结构 脱除条件
Trt TFA，HCl/HOAc，I2/MeOH
Acm I2/MeOH，Hg2+
Mob HF，TFMSA，Hg2+
表3 氨基常见保护基
简称 结构 脱除条件
Trt TFA，HOAc，HCOOH
Boc TFA，HOAc，HCOOH
Fmoc Pip/DMF，NaOH/MeOH
Dde H2NNH2/DMF
Allyl Pd（Ph3P）4，吗啉/THF
表3 羧基常见保护基
简称 结构 脱除条件
Otbu TFA，HOAc，HCOOH
OBzl H2/Pd，HF，TFMSA
OMe NaOH/MeOH
OAll Pd（Ph3P）4，吗啉/THF
OFm Pip/DMF，DBU/DMF
1.2．多肽缩合试剂
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代，按照其结构可以分为两种：缩合试剂主要有：碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）。
1.2.1．碳二亚胺型
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下：
图2 DIC活化反应机理
1.2.2．鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反应活性高，速度快，现在使用非常广泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啉（NMM），该试剂加入后，才能活化氨基酸。其反应机理如下：
图3 TBTU活化反应机理
1.3．多肽合成方法比较
1.3.1．液相多肽合成（solution phase synthesis）
液相多肽合成现在仍然广泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，象一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原因，无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。
图4液相合成Glu-Trp
1.3.2．固相多肽合成
图5 FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成现在使用的主要有两种策略：BOC和FMOC两种。BOC方法合成过程中，需要反复使用TFA脱BOC，而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF，由于HF必须使用专门的仪器进行操作，而且切割过程中容易产生副反应，因此现在使用受到实验条件限制，使用也逐渐减少。FMOC方法反应条件温和，在一般的实验条件下就可以进行合成，因此，也得到了非常广泛的应用。
1.3.2.1．固相合成中常用树脂
固相合成中树脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交联度在1-2%之间，现在使用的大多是1%，因为这种交联度下，树脂在DMF，DCM中具有很好的溶胀性能，立体上是一个空间网状结构，反应物分子可以在树脂内部自由移动。树脂中最关键的部分是连接手臂，它一端连接在树脂上，一端作为反应位点。目前广泛使用的树脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因为其对酸非常稳定，需要在HF，TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。
图6 固相合成常用树脂
1.3.2.2．茚三酮检测
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂包括：
A，6% 茚三酮的乙醇溶液
B，80% 苯酚的乙醇溶液
C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。
还有其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。
图7 茚三酮检测原理
1.3.2.3．固相合成切割方法
固相合成完成之后，必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来，然后经过冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品。由于选择的树脂不同，氨基酸序列不同，在切割时候，选择的切割方法也不完全相同，一般都是选择酸性条件下切割的条件，对于PAM，MBHA树脂，一般采用HF切割，切割过程中需要添加对甲苯酚，对巯基苯酚，苯甲醚等试剂。而对于Wang，Rink-Amide，Trt树脂，一般采用TFA切割，切割过程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三异丙基硅烷，苯酚等。这些添加试剂主要作为碳正离子俘获试剂使用，目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子，减少这些碳正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应，比较容易产生副反应的氨基酸有：Trp，Tyr。切割试剂用量一般10-15ml/g树脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反应一般是在室温条件下2h-4h。
1.3.3．多肽合成中主要问题
1.3.3.1．消旋及其反应机理
多肽合成过程中，部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋，特别容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，当然这些消旋化还和溶剂，温度以及合成中的有机碱等因素有关。对于这些氨基酸，可以通过采用高效缩合试剂，减少反应时间，可以减少消旋的比例，一般条件选择适当，消旋化都可以控制在5%以内。消旋反应机理如下：
图8 消旋反应机理
1.3.3.2．二酮哌嗪（DKP）反应
DKP副反应出现在FMOC-Wang树脂合成过程中，主要出现在第一个氨基酸为Pro的时候，当第二个氨基酸脱FMOC的时候，α-氨基被游离出来之后，立即对Wang树脂的苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同时从Wang树脂上释放出来，导致反应终止。该反应非常迅速，文献报道采用50%Pip/DMF，脱1min，4min的条件，但是我们实验证明在多数情况下，即使是1min左右反应就超过了20%。因此一般在末端第一个氨基酸为Pro的时候，建议采用2-Cl-Trt树脂合成，由于该树脂巨大的空间阻力，可以完全消除该副反应。这个副反应在BOC策略合成过程中，却可以完全避免，因为BOC在使用TFA脱除后，使氨基以TFA盐的形式存在，从而失去了亲核性，不能进攻苄酯键。
图9 DKP反应机理
1.3.3.3．困难序列多肽合成
固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低的问题，这里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因为有些多肽序列在树脂上形成β-折叠，改变了树脂的溶胀性能，还有可能将反应的活性位点埋藏在树脂里面，这样使得反应很难进行，目前报道使用的主要方法有：
1，使用混合溶剂，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液
2，提高反应温度，或采用微波方法
3，使用高离液盐，LiCl，NaClO4等。
4，使用溶胀性能更好的PEG-PS树脂，同时减少树脂担载量（0.05-0.2mmol/g）
